Rentgenová difrakční analýza flavin-dependentní oxidázy z termofilní houby Chaetomium thermophilum

A. Kravic¹, L. Švecová^{1, 2}, P. Kolenko^{1, 2}, L. H. Østergaard³, J. Dohnálek²

¹Fakulta Jaderná a Fyzikálně Inženýrská, České vysoké učení technické v Praze, Břehová 7, 115 19, Praha 1, Česká republika

²Biotechnologický ústav Akademie Věd České republiky, Biocev, Průmyslová 595, 252 50, Vestec, Czech Republic

³Novozymes A/S, Biologiens Vej 2, 2800 Kgs. Lyngby, Dánsko

kraviale@fjfi.cvut.cz

Flavin-dependentní oxidoreduktáza z termofilní houby Chaetomium thermophilum (CtFDO) je monomerní termostabilní glykoprotein. U této oxidoreduktázy CtFDO se očekává katalýza dvouelektronové oxidace primárních a sekundárních alkoholů doprovázena dvouelektronovou redukcí molekulárního kyslíku na peroxid vodíku. Pro svou aktivitu vyžaduje CtFDO oxidovaný (planární) stav kofaktoru FAD [1]. Ve všech strukturách tohoto proteinu se vyskytuje FAD v redukovaném (neplanárním) stavu. Oxidovaný stav FAD nebyl doposud ve strukturách CtFDO pozorován [2].

Pomocí vysoce intenzivního domácího zdroje rentgenového záření (D8 Venture) jsme se pokusili naměřit enzym CtFDO v oxidovaném stavu. Dále jsme se pokusili pozorovat postupnou redukci FAD v zavilosti na absorbované dávce záření. Naměřená difrakční data byla zpracována po segmentech, které vykazovaly dostatečnou kompletnost a rozlišení k pozorování strukturní změny FAD. Tato data jsme zpracovali programů XDS [3] a AIMLESS [4], struktura byla upřesněna pomocí programu REFMAC5 [5].

Již první segment poukazuje na redukovaný stav FAD. Na dalších segmentech difrakčních dat byla pozorována fluktuace elektronové hustoty v místě FAD. Nově navržené experimenty zohledňují tyto výsledky a povedou k pozorování oxidovaného stavu FAD ve struktuře enzymu CtFDO.

[1] Li, A.-N.; Li, D.-C.: J. Appl. Microbiol. 2009, 106, p. 369-380.

[2] Švecová L.; Skálová T.; Kovaľ T.; Østergaard L. H.; Kolenko P.; Dušková J.; Dohnálek J.: So, what does the enzyme do? Structural data-based identification of substrate specificity, 2018, Qeudlinburg, Germany (presentation).

[3] Kabsch W.: XDS. Acta Cryst., 2010, D66, s. 125–132.

[4] Evans P. R.; Murshudov G. N.: How good are my data and what is the resolution? Acta Cryst., 2013, D69, s. 1204–1214.

[5] Murshudov G. N. et al.: REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Cryst., 2011, D67, s. 355-367.

Tato práce byla podpořena Grantovou agenturou ČVUT v Praze (SGS19/189/OHK4/3T/14) a projekty MŠMT (CAV - CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000778).