Bilirubin oxidáza: Strukturní analýza komplexů s ligandy v aktivním místě a studie aktivit

L. Švecová^1,2, T. Koval’¹, T. Skálová¹, J. Stránský^1,2, L. H. Østergaard³ &
J. Dohnálek¹

¹Biotechnologický ústav AV ČR, v. v. i., Biocev, Průmyslová 595, 252 50, Vestec, Česká republika

²Fakulta jaderná a fyzikálně inženýrská, České vysoké učení technické v Praze, Břehová 7, 115 19, Praha 1, Česká republika

3Novozymes A/S, Brudelysvej 26, DK-2880 Bagsværd, Denmark

Bilirubin oxidáza z rostlinného patogenu Myrothecium verrucaria (BOD; EC 1.3.3.5) katalyzuje oxidaci bilirubinu na biliverdin, čehož je využíváno v medicíně při stanovení hladiny bilirubinu v krvi při vyšetření jater. Kromě bilirubinu je tento enzym schopen katalýzy oxidace mnoha dalších aromatických a některých anorganických sloučenin. Fyziologická funkce bilirubin oxidázy v přírodě nebyla dosud odhalena.

Vlastnosti jako jsou katalýza oxidace širokého spektra látek, enzymatická aktivita v širokém rozsahu pH, využití kyslíku jako druhého substrátu či stabilita při vyšších teplotách činí BOD atraktivním pro mnohé biotechnologické a průmyslová aplikace [1, 2].

Přestože prostorová struktura BOD byla již popsána (PDB kód: 2XLL [3], 3ABG [4]), otázky týkající se místa vazby substrátu a aminokyselin účastnících se na přenosu elektronu ze substrátu k primárnímu akceptoru elektronu – iontu mědi (T1) nebyly dosud zodpovězeny. Hlavní motivací pro další studie BOD je právě hledání odpovědí na tyto otázky.

Byly vypěstovány krystaly komplexů BOD s navázanými ligandy v aktivním místě a vyřešena jejich struktura. Na základě těchto struktur komplexů byl navržen koncept existence dvou vazebných míst pro substrát (pro negativně nabité částice a pro aromatické sloučeniny). Inhibiční studie ukazují, že obě místa hrají důležitou roli. Na základě získaných výsledků byly navrženy cílené mutace BOD. Na základě naměřených aktivit BOD a jejích mutantů vůči různým typům substrátu byla diskutována nejpravděpodobnější cesta elektronu od substrátu k T1.

[1] Kosman, D. J. (2010), J. Biol. Inorg. Chem. 15: 15-28.

[2] Durand, F., Kjaergaard, C. H., Suraniti, E. et al., (2012), Biosens. Bioelectron. 35(1), 140-146.

[3] Cracknell, J. A., McNamara, T., Lowe, E. D. et al., (2011), Dalton Trans. 40: 6668-6675.

[4] Mizutami, K., Toyoda, M., Sagara, K. et al. (2010), Acta Cryst. F 66: 765-770.

Tato práce byla podpořena projektem BIOCEV (CZ.1.05/1.1.00/02.0109) a projektem Strukturní dynamika biomolekulárních systémů (CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000447) z Evropského fondu pro regionální rozvoj a Grantovou agenturou ČVUT v Praze (grant č. SGS16/246/OHK4/3T/14).