Krystalizace proteinů je po téměř sto let empirických zkušeností již poměrně dobře zvládnutý proces. V současné době spoléhá proteinová krystalizace na testování mnoha tisíců krystalizačních podmínek, které v minulosti daly pro některé proteiny dobré výsledky. Pokud není krystalizace úspěšná, zkouší se jiné krystalizační screeny v naději, že některý jiný bude třeba fungovat. Poněkud frustrujícím faktem je, že ani v případě úspěšné krystalizace nikdo neví, jestli by některá jiná krystalizační podmínka neposkytla kvalitnější krystal.
Difrakční kvalita proteinových krystalů je stále principiální problém proteinové krystalografie. Difrakční metody jsou samy o sobě schopné měřit spolehlivě meziatomové vzdálenosti s přesností na setiny Angstromu [1]. Průměrná kvalita měřená pojmem "resolution" je ale u proteinových struktur deponovaných v PDB je pouze 2 Angstromy. Z racionálního hlediska je tedy krystalizace proteinů v poměrně neútěšné situaci poskytující kvůli nekvalitním vzorkům nepříliš dobré výsledky a vyřešení struktury stojí stále značné úsilí, vyžaduje pevné nervy a vyšší spotřebu obvykle velice drahoceného proteinu.
Proč je situace u proteinů jiná než u organických krystalů? Dlouholetá praxe s krystalizací proteinů ukazuje, že proteinový krystal vždy obsahuje velké množství nekrystalografické (tekuté) vody. Proteinový skeleton může existovat pouze v termodynamické rovnováze s 27 až 85 % dynamicky neuspořádaného roztoku uzavřeného uvnitř krystalu. Když si uvědomíme, že krystalický proteinový skeleton zachováná svoji pevnost i v pětinásobném množství vody, je zřejmé, že architektura proteinového skeletonu krystalu hraje mimořádně důležitou roli.
Při krystalizaci organických nebo anorganických materiálů dochází k účinné separaci krystalujícího materiálu z rozpouštědla a molekuly v krystalu vytváří obvykle souvislý pravidelný kompaktní blok s nepatrnými zbytky rozpouštědla. U proteinových krystalů je situace velice odlišná. Proteinové molekuly zachovávají velkou část svojí hydratační slupky a drží v krystalu vodu až do pětinásobku svoji hmotnosti. Architektura proteinových krystalů připomíná konstrukci moderních budov, u kterých je stabilita zajištěna tenkým nosným železobetonovým skeletonem a kde sádrokartonové přepážky uvnitř budovy nemají z hlediska stability velkou roli. Obdobně, stabilita proteinového krystalu závisí na pevnosti a uspořádání mezimolekulárních interakcí protein-protein. Porozumění mezimolekulární adheze (mezi molekulami proteinů a také mezi molekulami proteinů a aditiv záměrně přidávaných do krystalizačního roztoku) hraje proto klíčovou roli při řízení krystalizace proteinů.
Nová dynamická teorie krystalizace proteinů se snaží vysvětlit adhezní jevy řídíci proces krystalizace a umožnit tak racionální řešení této časově a nervově obvykle nejnáročnější části řešení molekulární struktury biologických makromolekul [2]. Základem dynamické teorie krystalizace proteinů je teorie adhezních módů vycházející z analýzy adhezních módů pozorovaných v krystalových strukturách deponovaných v PDB, dále z analýzy mnohem přesněji [1] pozorovaných interakcí v CSD, a také z analýzy interakcí popisovanými jinými analytickými metodami, které dovedou poskytnout také jisté informace o existenci mezimolekulárních klusterů v koncentrovaných roztocích. Pojem adhezní mód je názorný, ale jak uvidíme, vzhledem k jeho univerzalitě ho není snadné přesně definovat. Jak ale ukážeme na příkladech, je to v mnoha případech užitečný a často srozumitelný pojem.
Obrovská plocha povrchu proteinu vždy nabízí větší počet adhezních ploch s různou afinitou. Pokud se v rostoucím "krystalu" uplatní různé adhezní módy, molekuly budou různě orientované. Dostaneme možná pravidelný rigidní útvar, ale difrakční efekt bude minimální nebo nulový. Pro úspěšnou krystalizaci proteinů je proto mimořádně důležitý princip jediného dominantního adhezního módu (PSDAM – Principle of a Single Dominating Adhesion Mode), který musí řídit celý krystalizační proces bez ohledu na to jakým mechanizmem růst probíhá. Zárukou úspěšné krystalizace je tedy cílené řízení pravděpodobnosti realizace vybraných krystalově kompatibilních adhezních módů.
Dalším klíčovým nezbytným pojmem jsou molekuly aktivní na povrchu molekul proteinů - modifikující vlastnosti povrchu proteinů [3]. Označujeme je zkratkou PSAM – “Protein Surface Active Molecules”. Tyto molekuly jsou záměrně přidávané do krystalizačního roztoku, a adherují (s nízkou afinitou !!) na dobře definované adhezní plochy na proteinových molekulách. PSAM takto dočasně mění adhezní vlastnosti proteinových molekul - buď aktivují a nebo pasivují vybrané adhezní módy mezi proteinovými molekulami vytvářející krystalový skeleton.
Máme tedy k dispozici velice efektivní a snadnou metodu ovládání afinity mezi proteinovými molekulami a tedy máme racionální cestu jak zajistit dominantní roli zvoleného adhezního módu zaručující dobrou periodicitu a difrakční schopnost rostoucího krystalu. Možnost racinálně volit architekturu proteinových krystalů a možnost optimalizovat difrakční schopnost proteinových krystalů nabízí možnost zlepšit efektivitu metod stanovení struktury biologických materiálů v atomárním rozlišení.
· Znalost protein-protein adhezních módů využíváme ke stavbě proteinového skeletonu rostoucího krystalu. Je obtížné předvídat tyto adhezní módy pomocí molekulárního modelování, protože jejich stabilita je vždy zásadně ovlivněna dynamickou vrstvou většího množtví molekul vody, iontů atd. Z praktického hlediska je proto logické vycházet zejména z experimentálně pozorovaných adhezních módů.
· Znalost protein-PSAM adhezních módů využíváme k pasivaci a nebo aktivaci protein-protein vybraných adhezních módů, abychom zaručili dominanci řídícího adhezního módu [3]. Funkci PSAM má řada iontů (solí), molekul, oligomerů a polymerů. Významnou roli zde hraje PEG poly(ethylene glycol) jehož role byla již dobře popsána [4,5].
Pokud chceme racionalizovat krystalizační proces, je třeba princip dominantního adhezního módu akceptovat vždy bez ohledu na to, jakou metodu krystalizace chceme použít. Současné metody proteinové krystalizace jsou v zásadě empirické a výše uvedenými principy se příliš neřídí. Zde se zmíníme o důslecích vyplývajících z dynamické teorie krystalizace, z principu jediného dominujícího adhezního módu a ze znalosti vlivu PSAM na adhezní vlastnosti povrchu proteinu, pro stávající metody proteinové krystalizace:
· výběr optimálních homologů proteinu pro krystalizační screening
· výběr mutačních míst pro krystalizaci založenou na mutacích cílového proteinu, tj. chemické a biochemické mutace, metylace lysinů, redukce povrchové entropie, atd.
· výběr PSAM pro krystalizaci řízenou chemickým složením krystalizačního roztoku,
· dopad na další empiprické krystalizační metody, tj. elektrické, magnetické pole, proud, vibrace, gravitace, atd.
Přestože jsou nově definované přístupy a pojmy názorné a přirozené, většina stávajících metod krystalizace proteinů je stále založena na masivním testování “nekonečného” množství racionálních i iracionálních experimentů bez dostatečného vysvětlení pozorovaných efektů. Předpokládáme, že respektování důsledků vyplývajících z dynamické teorie, z principu dominujícího adhezního módu, a znalost funkce PSAM pomohou zefektivnit postupy používané při krystalizaci proteinů a zlepšit tak přesnost a spolehlivost stanovení struktury biomolekulárních systémů.
1. Hašek, J., Chemické listy, 105, (2011), 467-475.
2. Hašek, J., Materials Structure, 23, (2016), 341.
3. Hašek, J. et al, J. Synchr. Radiation, 18, (2011), 50-52.
4. Hašek, J., Z. Kristallogr., 28, (2011), 475-480.
5. Hašek, J. et al, Z. Kristallogr., 23, (2006), 613-618.
Podporováno projekty BIOCEV (ERDF CZ.1.05/1.1.00/02.0109) a GAČR (15-15181S).