Semi-automatické hledání ligandů v proteinových strukturách

F. Pavelčík¹, J. Václavík²

¹Ústav chemických léčiv, ²Ústav přírodních léčiv

Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Palackého 1-3, 61242 Brno

pavelcikf@vfu.cz

Keywords: Protein-ligand complex, rotation function, translation function, ligand docking

Úvod

Automatizované hledání ligandů v protein-ligandových komplexech je žádané v některých moderních metodách designu léčiv jako je např. FBDD (fragment-based drug design). FBDD je relativně nová metoda [1] objevování léčiv. Místo hledání celého léčiva se hledají nejprve jednotlivé malé fragmenty, které mají doplňkový povrch a vysokou interakční energii k aktivnímu místu cílového proteinu. Výběr cílových proteinů byl umožněn současným dramatickým rozvojem metod molekulární biologie, genetiky a příbuzných disciplin. Principiální průlom v designu léčiv je vyžití fyzikálních metod screeningu jako je NMR nebo rtg. krystalografie místo farmakologického screeningu (HTS). Princip FBDD metody je velmi jednoduchý a je zobrazen na obr. 1. Malé fragmenty se následně spojí chemickými metodami do větší molekuly, tak aby prostorové rozložení funkčních skupin bylo stejné jako ve struktuře protein-ligandových komplexů. Klasické farmakologické nebo biochemické metody obyčejně vůbec nejsou schopné detekovat požadovanou biologickou aktivitu těchto malých fragmentů.

Obr. 1. Princip fragmentové metody designu léčiv.

V rtg. metodách se používá koktejl 4-10 malých molekul z knihovny obsahující řadově 100 sloučenin. Pokud by byla cílová molekula složena ze tří fragmentů je taková knihovna ekvivalentní knihovně jednoho milionu testovaných sloučenin. Uvedený koktejl se aplikuje na nativní proteinový krystal, který si sám vybere nejvhodnější sloučeninu. Tento proces se opakuje s jinými koktejly. Následný difrakční experiment je plně automatizový a celý krystalografický screening trvá pouze desítky hodin. Úlohou proteinové krystalografie je určit typ navázaného ligandu a jeho pozici v proteinové struktuře.

Metoda

Naše metoda [2] na lokalizaci malých molekul v protein-ligand komplexech, fázovaná rotační-konformační-translační funkce (PRCTF) je určitou analogií metody molekulového nahrazování (MR). Všeobecně, PRCTF je principiální nástroj na lokalizaci molekulových fragmentů v elektronové hustotě krystalu a může být formulována jako

(1)

kde ρ_c je elektronová hustota krystalu, definovaná pro kouli o objemu V (s poloměrem R_ex) v okolí mřížkového bodu, který přísluší translačnímu vektoru t. ρ_f je elektronová hustota hledaného fragmentu. Elektronová hustota fragmentu je funkcí konformace (vektor torzních úhlů, τ) a orientace (tři Eulerový uhly, vektor α). Geometrický střed fragmentu je umístněn do počátku souřadného systému. Elektronovou hustotu v kouli je možné popsat pomocí sférických harmonických (Y_lm) a sférických Besselových [g_l(k_nlr)] funkcí (určitá analogie atomových orbitalů, s využitím hlavního, orbitalového a magnetického kvantového čísla) a rozvojové koeficienty je možné vypočítat ze strukturních faktorů:

(2)

(3)

Analogicky je možné určit rozvojové koeficienty elektronové hustoty fragmentu:

(4)

Orientaci fragmentu je potom možné počítat pomocí FFT. Koeficienty C_lmm se vypočítají z koeficientů a_nlm a b_nlm. D_mm jsou Wignerovy matice pro moment hybnosti používané v kvantové mechanice.

(5)

V PRCTF se na lokalizaci fragmentů v elektronové hustotě, v skutečnosti elektronová hustota vůbec nepoužívá. Metoda je implementována v programu NUT [2].

Pro velmi malé fragmenty, nízké rozlišení nebo nepřesné fáze strukturních faktorů nemá překryvový integrál (1) někdy dostatečnou schopnost odlišit správná a falešná řešení. Za tímto účelem byl napsán malý program DOK, který počítá interakční energii mezi ligandem a proteinem v příslušné proteinové dutině (cavity). Kombinací dvou fyzikálně odlišných přístupů je možné eliminovat prakticky všechna nesprávná řešení.

Odkazy

1. W. Jahnke, D.A. Erlanson, Fragment-based Approaches in drug Discovery, WILEY-VCH, Weinheim, Germany, 2006.

2. F. Pavelcik, J. Appl. Cryst. 39, (2006), 483-486.