INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE – CO NÁM MOHOU VIBRACE ŘÍCI O (BIO)MOLEKULÁCH

 

V. Baumruk

 

Univerzita Karlova v Praze, Matematicko-fyzikální fakulta, Fyzikální ústav UK, Ke Karlovu 5, 121 16 Praha 2

 

Objasnění struktury biologických makromolekul a vztahu mezi jejich strukturou a funkcí patří mezi jeden z hlavních úkolů biofyziky a molekulární biologie. Na monokrystalické vzorky lze aplikovat metody rentgenové strukturní analýzy, zatímco pro řešení struktury v roztoku (s určitým omezením daným velikostí studované molekuly) metody nukleární magnetické rezonance (NMR). Avšak pro pochopení mechanismů na molekulární úrovni je nutná rovněž detailní znalost mezimolekulárních interakcí (například systému vodíkových vazeb, nábojového rozložení atp.), kterou v řadě případů nelze jednoznačně odvodit ze známé třídimenzionální struktury biopolymerů. Proto pro řešení mnoha problémů vztahu struktury a funkce nutně potřebujeme další experimentální metody poskytující jedinečnou a komplementární informaci o zkoumaném systému. Právě v této oblasti nacházejí široké uplatnění metody vibrační spektroskopie: infračervená (IČ) spektroskopie a Ramanův rozptyl. Jsou založeny na dvou fyzikálně rozdílných jevech (absorpci respektive rozptylu), obě však umožňují studovat přechody mezi vibračními stavy molekul v základním elektronovém stavu. Jejich společným rysem je nedestruktivnost, hlavním přínosem potom možnost získání poměrně detailní strukturní informace, která je často jinými metodami obtížně zjistitelná. Tyto metody lze použít na vzorky plynné, kapalné i pevné; mohou to být roztoky, suspenze, gely, tenké vrstvy, vlákna a monokrystalické, práškové či amorfní vzorky. Data získaná na vzorku v daném morfologickém stavu jsou přenositelná na stejný vzorek v jiném morfologickém stavu.

Metody vibrační spektroskopie umožňují studovat biologické látky v jejich přirozeném prostředí, tedy ve vodných roztocích, sledovat nejen změny struktury vyvolané změnou fyzikálně-chemických parametrů (například změnou pH, iontové síly, teploty, vlhkosti ...), ale i dynamiku strukturních přechodů. Ve srovnání s fluorescencí (~10-9 s) a nukleární magnetickou rezonancí (~10-6 s) probíhají jak Ramanův rozptyl tak i IČ absorpce ve velmi krátké časové škále (~10-15 s). Vibrační spektroskopie je tedy vhodnou metodou studia dynamiky biologických procesů. V případě konformačně flexibilních molekul může vibrační spektroskopie rozlišit konformace, jež jsou stabilní z hlediska časové škály vibračních pohybů. Na rozdíl od NMR, kde díky pomalejší časové škále (v porovnání s konformační konverzí) může ve spektru dojít k vyrušení strukturních rysů, je vibrační spektrum váženým průměrem spekter jednotlivých konformerů.

Pokud jde o výběrová pravidla, vibrace indukující změnu dipólového momentu molekuly se projeví v IČ spektrech, zatímco vibrace indukující změnu polarizovatelnosti molekuly se projeví v Ramanových spektrech. Díky rozdílným výběrovým pravidlům jsou Ramanova a IČ spektroskopie do jisté míry komplementární – některé vibrace mohou být aktivní v obou těchto metodách, některé jen v jedné z nich a některé mohou být v obou neaktivní. Plná komplementarita nastává u středově symetrických molekul, kdy vibrace symetrické vůči středu inverze jsou aktivní v Ramanových a vibrace antisymetrické vůči středu inverze jsou aktivní v IČ spektrech.

Pásy ve vibračním spektru lze v přeneseném slova smyslu chápat jako jakýsi unikátní "otisk" molekuly (právě proto patří vibrační spektroskopie mezi široce využívané analytické metody). Pro malé až střední molekuly lze provést přiřazení spektrálních pásů normálním vibracím na základě modelových výpočtů spekter ať už na fenomenologické (řešení inverzního vibračního problému) či ab initio úrovni. Při dobré shodě vypočteného spektra s experimentálními daty potom získáváme základní informaci o rovnovážné konfiguraci jader a o silových polích. U složitých molekul však takové přímé přiřazení není proveditelné a tudíž ani není možná přímá strukturní interpretace vibračního spektra. Strukturní interpretace vibračních spekter biomolekul je založena na tzv. konformačních markerech, to jest spektrálních pásech, které jsou jednoznačně přiřazeny určité molekulární struktuře stanovené nezávislou metodou. Zdrojem referenční strukturní informace pro stanovení korelace mezi spektrálními a strukturními rysy jsou zpravidla krystalografická či NMR data. Protože každý pás ve vibračním spektru odpovídá vibracím určité skupiny atomů (tzv. normální vibraci) s dobře definovanými geometrickými charakteristikami (délka vazeb, úhly vazeb, …), může správně přiřazený pás sloužit jako jednoznačný indikátor odpovídajícího strukturního rysu. Interpretace vibračních spekter biopolymerů by samozřejmě nebyla možná bez detailní interpretace spekter jejich složek.

Vibrační optická aktivita (VOA, vibrační spektroskopie pracující s kruhově polarizovaným světlem) v sobě spojuje stereochemickou citlivost konvenční (UV-VIS čili elektronové) optické aktivity s vyšším rozlišením a tudíž i bohatším strukturním obsahem a konformační citlivostí vibrační spektroskopie. Podobně jako vibrační spektroskopie, zahrnuje i vibrační optická aktivita dvě samostatné a do značné míry komplementární metody – vibrační cirkulární dichroismus (VCD) a Ramanovu optickou aktivitu (ROA). Je to ve své podstatě technika diferenční spektroskopie, kdy měříme rozdíl v odezvě chirální molekuly vůči levo- a pravotočivě kruhově polarizovanému záření. Výsledkem měření VOA jsou vždy dvě spektra – vlastní VOA (tedy diferenční) spektrum a zdrojové vibrační spektrum. Citlivost vibrační optické aktivity k zrcadlově symetrickým vztahům mezi enantiomery chirálních molekul je zdrojem její pozoruhodné schopnosti specifikovat absolutní stereochemické vlastnosti chirálních molekul v roztoku.

Jak infračervená spektroskopie tak i Ramanův rozptyl mají své přednosti i nedostatky, ale kombinace obou dává experimentátorovi do rukou dostatečně mocný nástroj pomáhající řešit úkoly stojící před molekulární biologií, biofyzikou a biochemií.