Zpracování difrakčních dat krystalů biologických makromolekul získaných
oscilační metodou.
Měření difrakčních dat je základní experiment v krystalové strukturní analýze. Především díky vysokému obsahu rozpouštědla a subtilnosti mezimolekulárních interakcí tvořících architekturu krystalu, jsou krystaly citlivé na radiační poškození. Proto je jedním z nejdůležitějších úkolů změřit kompletní data v co nejkratším čase. Nedávný technický pokrok v měřících metodách, jako např. používání synchrotronového záření, měření zmražených krystalů a vysoce citlivé plošné detektory, usnadnil měření, ale to stále zůstává základem celé strukturní analýzy. Vzhledem k charakteru naměřených dat se v průběhu zpracování setkáváme s problémy společnými pro zpracování všech monokrystalových dat nebo problémy specifickými pro použití plošného detektoru, případně problémy specifickými pro krystaly biologických makromolekul.
V příspěvku se
omezím na zpracování dat typicky naměřených na
monokrystalech biologických makromolekul. Jak již bylo výše uvedeno,
základním problémem je čas, po který je krystal stabilní (čas ve kterém lze na
krystalu měřit více či méně reprodukovatelná data), proto je použití plošných
detektorů prakticky podmínkou.
Při zpracování difrakčního experimentu naměřeného na monokrystalu biologické makromolekuly při detekci plošným detektorem začínám zpracováním prvního snímku (nebo několika prvních snímků). Základním úkolem je vyhledat vhodné reflexe, určit co nejpřesněji jejich polohu vzhledem k posici nedifraktovaného záření (primárního záření). Tato data spolu s daty, která popisují geometrii experimentu (viz. Tab. 1), jsou pak předána programu, který nám nabídne možné krystalové uspořádaní, parametry buňky a orientaci krystalu. Nabídka jednotlivých Bravaiseho ?! mřížek je sortována podle poziční shody reflexí změřených a vypočtených. Z nabídky volíme buňku s nejvyšší symetrií a přijatelnou hodnotou parametru popisující diferenci mezi experimentálně zjištěnými difrakcemi a předpovězenými difrakcemi.
Tab. 1
Známé parametry popisující difrakční experiment.
Pokud jsme si již vybrali krystalovou soustavu, je vhodné jak parametry buňky tak přístrojové parametry upřesnit podle několika snímků nejlépe s rozdílnou hodnotou oscilčního úhlu j. Dále je třeba zadat parametry divergence svazku a odhadnout mosaicitu krystalu. Pokud jsme vše výše uvedené provedli korektně měli bychom být schopni provést integraci difrakcí na jednotlivých snímcích. Pro integraci je ještě velice důležité určit oblast integrace reflexe a oblast pro určení výšky pozadí. Před integrací samotnou se ještě vždy provádí upřesnění parametrů ovlivňujících polohy reflexí, jelikož bohužel jsou tyto parametry přes veškerou snahu experimentátorů proměnné. Integrace samotná je pak téměř u všech programů prováděna jednak prostou sumací přes zvolené elementy detektoru (s odečtem pozadí) a dále na základě integrace pod profilem získaným profilovaou analýzou. Ačkoli se v této části zpracování jednotlivé programy značně liší, výsledkem je soubor dat který popisuje pro každou jednotlivou reflexi na jednotlivém snímku toto:
1. Millerovy indexy h k l
2. Intenzita záření odhadnutá na základě součtu přes dané buňky detektoru.
3. Odhad chyby intenzity (z bodu 2).
4. Intenzita záření odhadnutá na základě proložení idealního profilu.
5. Odhad chyby intenzity (z bodu 4).
6. Pozice reflexe.
7. Údaj o vypočtené parcialitě reflexe.
Z uvedeného je zřejmé, že pro získání kompletního neredundatního souboru dat, je třeba z výše uvedených dat získat za prvé celkové integrální intenzity reflexí změřených po částech na několika snímcích a za druhé vícenásobně změřené reflexe průměrovat. Tento proces nazýváme škálováni – snažíme se pomocí škálových a dalších parametrů co nejlépe sjednotit reflexní intenzity.
K celému postupu používáme většinou tři nejběžněji používané sobory programů: XDS[1,2], HKL[3] nebo MOSFLM[4]. Všechny obsahují základní moduly pro indexaci, integraci a škálování s výjimkou programu MOSFLM na který navazuje program Scala[5,6], součást souboru program CCP4[7].
1 Kabsch, W. (2001) Chapter
25.2.9. XDS. In International Tables
for Crystallography, Volume F. Crystallography of Biological Macromolecules,
Rossmann,M.G. and Arnold, E., ed. (Dordrecht:
Kluwer Academic Publishers), pp. 730 - 734
2 Kabsch, W. (2001) Chapter 11.3. Integration, scaling, space-group assignment and post refinement. In International Tables for Crystallography, Volume F. Crystallography of Biological Macromolecules, Rossmann,M.G. and Arnold, E., ed. (Dordrecht: Kluwer Academic Publishers), pp 218 – 224
3 Z. Otwinowski and W. Minor, " Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode ", Methods in Enzymology, Volume 276: Macromolecular Crystallography, part A, p.307-326, 1997,C.W. Carter, Jr. & R. M. Sweet, Eds., Academic Press (New York).
4 Leslie A.G. (1996): Mosflm user guide. http://www.dl.ac.uk/SRS/PX/jwc_external/abs_mosflm_suite.html
5 P.R.Evans, "Data reduction", Proceedings of CCP4 Study Weekend, 1993, on Data Collection & Processing, pages 114-122
6 http://www.ccp4.ac.uk/dist/html/scala.html - Scaling
7 Collaborative Computer Project Number 4 (1994): The CCP4 suite – programs for protein crystallography. Acta Cryst D 50: 760-763
Podrobná osnova příspěvku.
1. Úvod
2. Indexace
3. Rafinace parametrů
4. Integrace reflexí na jednotlivých snímcích
5. Redukce dat
6. Programové vybavení
6.1. XDS
6.2. HKL
6.3. Mosflm + Scala
7. Porovnání programů
8. Závěr