PROTEINOVÝ DIFRAKTOMETR ≈ MĚŘENÍ ROTAČNÍ METODOU

 

J. Brynda1

1Department of Gene Manipulation, Institute of Molecular Genetics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Flemingovo nam. 2, 166 37 Prague 6, Czech Republic

 

Úvod

 

Měření difrakčních dat je základní experiment v krystalové strukturní analýze. Pro struktury malých molekul jsou běžně měřena data do atomového rozlišení ( většinou do 0.8 Å),  takže fázový problém může být řešen přímo a pozice atomů mohou být rafinovány plně anizotropním modelem.

 Krystaly makromolekul jsou z hlediska měření difrakčních dat mnohem problematičtější. První problém vyplývá z velikosti elementární buňky, díky které jsou průměrné intenzity reflexí mnohem nižší a jejich počet vyšší ( tabulka 1). Za druhé, část objemu krystalu tvoří kanály vyplněné neuspořádaným rozpouštědlem, takže dále snižují intenzitu reflexí na vysokém rozlišení a ve většině případů omezují rozlišení na mnohem nižší než atomové. Za třetí, opět především díky obsahu rozpouštědla, jsou krystaly citlivé na radiační poškození. Nedávný technický pokrok v měřících metodách, jako např. používání synchrotronového záření,  měření zmražených krystalů a vysoce účinné  plošné detektory, usnadnil měření, ale to stále zůstává základem celé strukturní analýzy. Proto je nezbytné tomuto klíčovému kroku věnovat maximální pozornost.

 

Tabulka 1. Velikost elementární buňky a počet reflexí.

Sloučenina

Mřížkový parametr[Å]

Objem  buňky[Å] 

Počet reflexí

Prům. intenzita

Organická sl.

10  0

1000

2000

1

Supermolekula

30  0

27000

        30000

1/27000

Protein

100  0

            1000000        1

100000

1/1000000

Virus

400  0

100000000

1000000

1/100000000

 

1.      Součásti proteinového difraktometru

 

Pro sběr dat z makromolekulárního monokrystalu při konkrétní vlnové délce potřebujete difraktometr složený z následujících součástí:

(1)   zdroj RTG záření

(2)   optickou soustavu pro fokusaci  RTG záření na vzorek

(3)   monochromátor pro selekci jedné vlnové délky záření

(4)   kolimátor pro úpravu rozměrů  RTG záření

(5)   „závěrku“ (shuter) pro kontrolu expozice vzorku

(6)   goniostat spojený s držákem vzorku

Dále je velice vhodné mít k dispozici:

(1)   zařízení pro měření zmražených krystalů

(2)   účinný plošný detektor

(3)   software pro měření, ukládání  a zobrazování exponovaných dat

(4)   software pro zpracování dat, tj. získání intenzit jednotlivých Braggovských  difrakcí a jejich chyb.

 

 

 

 

2.      Zdroj RTG záření - rotační anoda

 

Ve strukturní analýze makromolekul je praktiky vždy používána  Cu anoda s fixní vlnovou délkou 1.542 Å (pokud není zdrojem synchrotronové záření). Rotační anoda má proti klasické rentgence výhodu vyšší intenzity RTG záření. Systémy jsou dnes běžně vybaveny grafitovým monochromátorem, nebo fokusačními zrcadly, nebo vícevrstvou optikou (Osmic), které zajišťují fokusaci a  monochromatizaci RTG záření. Velice důležitá je volba apretury kolimátoru, ta by měla odpovídat velikosti krystalu,  avšak pro velké krystaly s velkou elementární buňkou je lépe požít kolimator s menší apreturou něž velikost krystalu pro lepší prostorové rozlišení reflexí.

 

3.  Goniostat a detektor

 

Difrakční podmínka je pro konkrétní reflexi splněna pokud odpovídající bod reciproké mříže protíná plochu Ewaldovy sféry. Pokud je ozařován stacionární krystal RTG zářením, pak pouze některé reflexe splňují difrakční podmínku. Proto pokud chceme změřit vetší množství dat ( pokud možno všechny měřitelné, tj. kompletní soubor dat), musíme změnit buď velikost Ewaldovy sféry nebo orientaci krystalu. První možnost, s využitím polychromatického, „bílého“ RTG záření je základ Laueho metody. Pokud používáme monochromatické záření vybrané vlnové délky, pak musíme geometrii krystalu během expozice měnit tak, aby byly difrakční podmínky splněny pro více reflexí. Proteinové difraktometry prakticky vždy požívají rotaci krystalu a plošný detektor.

Prvním plošnými detektory byly fotografické filmy automaticky snímané optickými denzitometry. Takto digitalizované difrakční obrazce byly přeneseny na disk. Hlavní nevýhody použití fotografických filmů byla pracnost, časová náročnost, vysoké pozadí a malý dynamický rozsah. Postupně byly vyvinuty další  plošné detektory: drátové proporcionální čítače, „Imaging plates“ a konečně CCD detektory ( charge-coupled devices ). Prakticky všechny současné plošné detektory jsou dnes používány v kombinaci s goniostatem, který zajišťuje rotaci krystalu okolo jedné osy během expozice. Zbylé přístroje vyžívají kappa geometrie (ω, κ, φ) kolíbky goniometru pro nastavení krystalu do další počáteční polohy, ale během měření taktéž rotují krystal kolem jedné osy.

 

4. Základy rotační metody

 

Při použití Ewaldovy  konstrukce (obr. 1), která je geometrickou interpretací Braggova zákona, je monochromatické záření representováno povrchem koule o poloměru 1/l a krystal reciprokou mřížkou. Reciproká mřížka sestává z bodů ležících na konci vektorů kolmých k difrakčním rovinám a jejich délka je úměrná převrácené hodnotě mezirovinné vzdálenosti 1/d. Při rotační metodě je krystal otáčen o daný úhel definovaný jako úhel j.

 

Obr.1 Ewaldova konstrukce. Bod reciproké mřížky leží na povrchu Ewaldovy sféry pokud je splněna následující trigonometrická podmínka: 1/2d = (1/l) sinq. Po jednoduché úpravě dostaneme Braggovu rovnici:

l = 2d sinq. Takže pokud bod s indexy hkl reciproké mřížky leží na povrchu Ewaldovy sféry, je splněna difrakční podmínka a dojde k difrakci v daném směru.

Pro krystal v jedné orientaci bude pouze malá část reflexí splňovat difrakční podmínku. Počet reflexí bude velice malý pro malé molekuly (v některých orientacích i nulový). Krystaly makromolekul mají však větší elementární buňky (a, b, c v řádu 100 Å), pokud srovnáváme s vlnovou délkou použitého záření, což v geometrické interpretaci znamená, že reciproká mřížka je velice hustě zaplněna vzhledem k velikosti Ewaldovy sféry. Z toho vyplývá, že mnoho reflexí difraktuje současně do různých směrů, jelikož mnoho bodů reciproké mřížky leží současně na povrchu Ewaldovy sféry. To také vysvětluje výhodu velkých plošných detektorů pro měření krystalů s velkou elementární buňkou. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Obr. 2  Rovina reflexí, která je přibližně kolmá k záření dá vzniknout elipse reflexí na detektoru.

 

Body reciproké mříže leží v rovinách, takže protínají Ewaldovu sféru v kružnicích. Odpovídající difraktované reflexe z centra Ewaldovy sféry tak tvoří kužely a jelikož při většině experimentů je detektor umístěn kolmo na směr primárního svazku záření, tvoří reflexe rovin elipsy (viz obr. 2). Pokud některá osa krystalu leží téměř paralelně s primárním zářením, elipsy vytvářejí soustředné kruhy s centrem ve středu detektoru. Všechny reflexe ležící na jedné kružnici (elipse) mají jeden index společný a pro necentrované buňky postupně vzrůstá o jednotku. Vzdálenosti mezi kruhy závisejí na převracené hodnotě parametru rovnoběžného s primárním zářením.

 

4.1. Mosaicita krystalu a divergence záření

 

Při Ewaldově konstrukci předpokládáme ideální zdroj záření s totálně paralelním zářením a ideální krystal se všemi elementárními buňkami stejně orientovanými, takže výsledkem by byly bodové, nekonečně ostré Braggovské difrakce. Reálné experimentální podmínky se od tohoto ideálu liší ve třech aspektech. Za prvé, dopadající záření není nikdy dokonale paralelní, za druhé, reálné záření není striktně monochromatické a za třetí, reálné krystaly jsou tvořeny malými mosaikovými bloky, které nejsou vzájemně přesně stejně orientované. Pokud měříme krystaly makromolekul při laboratorní teplotě je rozpětí vzájemné orientace mosaikových bloků (mosaicita) většinou do 0.05o, ale pokud krystaly měříme zmražené může mosaicita vzrůst až na 1o i více. Všechny tyto efekty ( schemataticky znázorněné na obr. 3) rozšiřují difrakce na větší rozsah rotace krystalu.

 

 

 

 

4.2. Rotační snímky a „lunes“

 

Pokud chceme změřit další reflexe, které v danné orientaci neleží na povrchu Ewaldovy sféry, při použití monochromatického záření, musíme krystalem otáčet aby pro další reflexe byly splněny difrakční podmínky. Pokud je krystal otáčen okolo jedné osy během po sobě následujících  expozicích,  jedná  se o rotační  metodu. V praxi  je rotační osa je skoro  vždy  osa

Obr. 3  Schematické znázornění divergence záření d a mosacity krystalu h. (a) V přímém prostoru, (b) v reciprokém prostoru, kde je Ewaldova sféra rozšířena díky konečné šířce pásu použité vlnové délky dl/l.

 

rotace kolmá k dopadajícímu záření, tak aby byla zachována symetrie mezi oběma polovinami kompletního snímku. Toto je nejčastěji používaná metoda při měření difrakčních dat krystalů makromolekul. Pokud je krystal rotován během expozice, elipsy popsané pro fixní pozici krystalu mění svojí pozici. Výsledkem je, že snímek vzniklý během expozice obsahuje všechny difrakce  mezi dvěmi limitními pozicemi elips na začátku a konci daná rotace, které tvoří tzv. „půlměsíce“ ( lunes ).

 

4.3.Částečně a úplně změřené difrakce

Při rotační metodě vznikají „lunes“ jež obsahují difrakce mezi elipsami vzniklými mezi místy, která byla na Ewaldově sféře proťata  danou rovinou reciproké mřížky  mezi začátkem a koncem rotačního intervalu Δφ. Pokud byla Ewaldova sféra proťata daným bodem reciproké mříže kompletně, je změřena úplně a naopak, pokud bod reciprokého prostoru prošel jen z části Ewaldovou sférou, dokončí průchod při další rotaci a daná reflexe je na jednotlivých rotačních snímcích registrována po částech. Vzhledem k velké hustotě reciproké mříže je nemožné změřit všechny reflexe naráz během jedné velké rotace,  jelikož by docházelo k překrývání difrakcí.

Na šířku „lunes“ má zásadní vliv mosaicita krystalu (vliv divergence a mosacity nelze jednoduše separovat, navíc divergence je prakticky konstantou pro daný zdroj a je většinou zanedbatelná ve srovnání s mosaicitou), pokud je mosacita malá jsou „lunes“ úzké, naopak velká mosaicita značně rozšiřuje plochu „lunes“ (viz obr. 4).

 

 

 

Obr. 4  Vzhled „lunes“: (a)  krystal s malou mosaicitou, (b) krystal s velkou mosaicitou.

 

4.4. Velikost rotačního intervalu

 

Zásadním parametrem rotační metody je velikost rotačního intervalu na jednotlivou expozici. V praxi existují dva základní přístupy: velké a malé rotační intervaly (v originále wide and fine slicing φ ). Obě metody mají své výhody i limitace. Jemné vzorkování minimalizuje pozadí, umožňuje přesné fitování difrakčního profilu ve φ. Hrubé vzorkování je vhodné pokud doba čtení z detektoru je relativně dlouhá a dále většina reflexí je změřena jako úplně  změřené. Na obr.5 můžete vidět vliv velikosti rotačního intervalu na šířku „lunes“.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Obr. 5  Šířka „lunes“ je úměrná Δφ (rotačnímu úhlu na jednu expozici). Velikost Δφ (rotační úhel na jednu expozici) roste od (a) do (c), až u (c) dochází k překryvu.

 

 

4.4.Vzdálenost krystal detektor

 

Dalším zásadním parametrem rotační metody je vzdálenost od  krystalu k detektoru (d). Na všech difraktometrech pro měření makromolekulárních krystalů je tato vzdálenost měnitelná, většinou je minimální vzdálenost limitována možnou srážkou detektoru s goniometrem nebo chlazením a maximální vzdálenost je dána konstrukční volbou výrobce. Čím kratší je d, do tím většího rozlišení je možno měřit. Jelikož je však rozlišení téměř vždy limitováno difrakční kvalitou vzorku, je vhodné nastavit vzdálenost tak, aby byla vhodně využita celá ploch detektoru (jak praví klasici proteinové krystalografie: „Je důležité měřit intenzity, nikoli indexy“.). S d souvisí i prostorové rozlišení jednotlivých difrakcí.  Další fakt, který je dobré vzít do úvahy je fokusace svazku záření, pokud je záření fokusováno na určitou vzdálenost, pak jsou difrakce nejlépe prokresleny v této vzdálenosti.

 

Literatura : International Tables for Crystallography, Volume F, 177 - 195