PROTEINOVÁ KRYSTALOGRAFIE NA ZDROJÍCH SYNCHROTRONOVÉHO ZÁŘENÍ

Jindřich Hašek

Ústav makromolekulární chemie AV ČR, Heyrovského nám.2, 162 06  Praha 6

 

V posledních dvaceti letech jsme byli svědky obrovského rozvoje molekulární biologie, který nastal poté co se podařilo zvládnout metodiku experimentálního stanovení molekulární struktury biologických makromolekul pomocí difrakce rtg záření. Znalost struktury nesmírně složitých komplexů má pro pochopení procesů odehrávajících se v biologických systémech základní význam a proto se „proteinová krystalografie“ stala nezbytnou součástí molekulární biologie a biotechnologických aplikací potřebných při návrhu léčiv. Proteinová krystalografie dovede v současné době popsat nejen molekulární strukturu a dynamiku, ale umožňuje i velmi přesný odhad slabých mezimolekulárních interakcí v makromolekulárních systémech (hydrofobní síly, hydratace, vodíkové můstky), které rozhodují o jejich struktuře a funkci. Velkou výhodou proteinové krystalografie je, že určuje strukturu proteinu a jeho interakce s okolím v jeho přirozeném vodném prostředí, umožňuje pozorovat změny struktury a adhezi mezi proteiny při změnách pH, atd. V návaznosti na zlepšující se dostupnost zdrojů synchrotronového záření, propojení s metodami molekulárního modelování a s NMR technikami, představuje rtg strukturní analýza v současné době nejsilnější a nejrychlejší nástroj studia struktury a funkce biologických systémů na molekulární úrovni.

 

Synchrotronové záření, u kterého je možné dosáhnout velice krátkých pulsů záření (okolo 100 psec) s obrovskou koncentrací energie záření na velice malé ploše (řádově desítky mikronů), podstatně rozšiřuje možnosti tradiční rtg strukturní analýzy. Nově zaváděné metody experimentálního stanovení struktury excitovaných systémů pomocí synchrotronového záření umožňují sledovat průběh některých chemických a biochemických reakcí s časovým rozlišením změn struktury až 100 ps.

 

Ve světě existuje mnoho desítek synchrotronů a některé z nich mají větší množství svazků záření využívaných pro proteinovou krystalografii. Následující tabulka ukazuje počty synchrotronů v různých zemích.

 

Armenie

1

Indie

2

Německo

6

Tajwan

1

Australie

1

Italie

2

Rusko

7

Thajsko

1

Brazilie

2

Japonsko

17

Singapur

1

Ukrajina

2

Čína

4

Jižní Korea

2

Španělsko

1

USA

12

Dánsko

2

Jordánsko

1

Švédsko

3

Velká Britanie

2

Francie

4

Kanada

1

Švýcarsko

1

 

 

 

Přestože v ČR obdobné zařízení nemáme, účast ČR v EMBL a smlouvy s mezinárodními středisky pro využití synchrotronového záření (ESRF v Grenoble a Electtra v Trieste) umožňují našim vědcům plnohodnotné provádění vlastních experimentů. V tomto příspěvku uvádíme stručný popis experimentálního vybavení center orientovaných na řešení problémů z molekulární biologie v ESRF, na zdroji synchrotronového záření Elettra a některých dalších vybraných laboratoří v Evropě a USA.

 

Vybraná evropská zařízení využívající synchrotronového záření

 

European Synchrotron Radiation Facility - ESRF

 

ID2 – Insertion device no. 2  – Biocrystallography

Undulátor s proměnnou vlnovou délkou nebo undulator s vlnovou délkou 1 Ĺ. Uhlíkové filtry absorbují vlnové délky nad 2.5 Ĺ. Monochromatisace pomocí kryogenicky chlazeného dvoukrystalového monolitického Si(111) monochromátoru. Koncentrace svazku pomocí „Rh-coated double focusing toroidal mirror“ s fixní geometrií zvyšující tok fotonů v místě vzorku 15 krát. Jsou použitelné pouze pro vlnové délky nad 0.73 Ĺ. Pětikruhový difraktometr - phi, chi, omega a dva 2theta kruhy s rameny osazenými dvěma detektory umožňuje orientaci vzorku a měření Freedelovských párů na stejném snímku. Difraktometr je řízen softwarem SPEC umožňujícím současnou práci obou detektorů. Eulerova geometrie s plnými kruhy.

 

ID9 – Insertion device no.  9 – Laueho metoda (White Beam Station)

Mnohafunkční zařízení. Široké spektrum vlnových délek umožňuje současnou registraci velkého počtu reflexí a usnadňuje tak provádění experimentů s krátkým časovým rozlišením (time resolved Laue diffraction).

Exposiční doba může být od mikrovteřin až do 100 ps při použití jednoho shluku elektronů na oběžné dráze synchrotronu. Femtosekundový laser laditelný v rozsahu 450-800 nm s délkou pulsu od 100 fs do 100 ps, 30 µJ na jeden puls. Běží s frekvencí 900 Hz s exposiční dobou od mikrosekund do 100 picosekund.

 

BM13–14 Bending magnet no.13-14 – Britsko-Španělské konsorcium 

 

ID13 – Insertion Device no.13 – Mikrofokusní proteinová krystalografie

Mikrodifraktometr umístěný zde dává velmi malý průměr (5/10/30 mikrometrů) primárního svazku vysoce koncentrovaného záření a má vynikající optiku pro justování mikrokrystalků.

 

ID14 – Insertion Device no.14 – Makromolekulární krystalografie

Na čtrnáctém segmentu jsou dva svazky záření (A,B) využívající wiglerů, každý se dvěmi experimentálními boudami (hutch 1,2,3,4).

ID14  Exper.Hutch 1

Standardní měření proteinů.

CCD detektor MAR 165mm. Chlazení vzorku na 100 K pomocí Oxford Cryostream.

ID14  Exper.Hutch 2

Standardní měření proteinů. Kolimace svazku záření dvěma páry stěrbin, kontrola intensity primárního svazku pomocí ionizační komory. Vzorek může rotovat kolem jedné osy (phi), registrace záření CCD detektorem firmy X-Ray Research s průměrem 165 mm. Doba přečtení 3.5 vteřiny. Chlazení vzorku na 100 K pomocí Oxford Cryostream.

ID14  Exper.Hutch 3

Zařízeni uváděné letos do provozu.

ID14  Exper.Hutch 4

Zařízeni vhodné pro anomální difrakci. SAD and MAD experimenty

 

Beamline ID23

Bude dokončena v příštím roce a bude dedikována automatickému měření proteinových krystalů. Dva undulátory budou sloužit dvěma koncovým stanicím  ID23-1 a ID23-2.

Stanice ID23-1 bude s laditelnou vlnovou délkou (6-20keV) pro experimenty s anomální difrakcí (MAD). Druhá stanice ID23-2 bude mít pevnou vlnovou délku odpovídající 14 keV.

 

ID29 – Insertion Device no.29 – Anomální difrakce (SAD,MAD)

Zařízení určené pro řešení obtížně řešitelných makromolekulárních struktur pomocí anomálního rozptylu (Single and Multiple-wavelength Anomalous Diffraction – SAD, MAD experimenty).

 

BM30A – Bending magnet no.30 -

Standardní měření difrakce proteinů. Svazek záření 0.3x0.3 mm, MAR 345 Image detektor, MAR CCD 165 mm, cold room.

 

EMBL Grenoble Outstation – Podpora experimentů v ESRF

 

EMBL Grenoble Outstation spolupracuje s European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) pokud jde o práci na svazcích záření ID9 (time resolved crystallography), ID13 (microfocus), ID14 (four protein crystallography endstations), BM14 (MAD) and ID29 (MAD).  Dává navíc k disposici výpočetní techniku, grafiku a laboratoře pro molekulární biologii a biochemii.

Grenoble Outstation of EMBL získala od Evropské unie grant „Improving Human Potential Programme (Access to Research Infrastructures)“ na léta 2000-2003, na podporu biologických experimentů v ESRF platný i pro asociované státy k EU, tedy i pro ČR. 

 

 

Středisko synchrotronového záření ELECTTRA v Trieste

 

V současné době je zde jedna laboratoř pro makromolekulární krystalografii. Je na společném svazku se zařízením pro maloúhlový rozptyl. Je vybavena detektorem (Image Plate MAR 345),  zařízením pro rotační metodu a rychlé zchlazení vzorku (flash cooling). Ve stavbě je další samostatný svazek pro proteinovou krystalografii.

 

 

Svazky synchrotronového záření využívané pro proteinovou krystalografii v USA

 

Nejdůležitější centra synchrotronového záření ve Spojených státech. Experimentální stanice určené pro proteinovou krystalografii jsou označené xtal:, další vztažené ke studiu proteinů jsou označené other:

(bližší informace lze nalézt na WWW stránkách uvedených na konci článku):

 

ALS: The Advanced Light Source, Lawrence Berkeley National Lab., Univ.of California at Berkeley

  xtal: 4.2.2   5.0.1   5.0.2   5.0.3   8.2.1   8.2.2   8.3.1    12.3.1     other: 4.0  

 

APS: The Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

  xtal: 5ID-B   14-BM-C   14-BM-D   14-ID-B   17-BM   17-ID   19-BM   19-ID   22-BM   22-ID   31-BM   31-ID  

  32-ID-B   other: 18-ID

 

CAMD: The Center for Advanced Microstructures and Devices , Louisiana State University

  xtal: GCPCC  

 

CHESS: Cornell High Energy Synchrotron Source, Cornell University

  xtal: A1   F1   F2  

 

SSRL: Stanford Synchrotron Radiation Laboratory,

  xtal: BL1-5   BL7-1   BL9-1   BL9-2   BL11-1   BL11-3     other: BL4-2   BL6-2   BL7-3   BL9-3  

 

NSLS: National Synchrotron Light Source, Brookhaven National Laboratory

  xtal: X4A   X4C   X6A   X8C   X9A   X9B   X12B   X12C   X25   X26C     other: X1A  

 

Pro naše uživatele je relativně nejdostupnější synchrotron v Brookhavenu mající tyto laboratoře:

 

Synchrotron „National Synchrotron Light Source“ v Brookhavenu, USA

Beamline X4A

Difrakční měření anomálně difraktujících vzorků - Multiwavelength Anomalous Diffraction (MAD)

Beamline X8C

Pro anomální difrakci na Se - Selenium Multiwavelength Anomalous Diffraction (Se-MAD)

Beamline X9B

EXAFS, SAS maloúhlový rozptyl a měření anomálního signálu v reálném čase (time resolved X-ray anomal scattering)

Beamline X12B

Universální difraktometr, MAD, zasilatelská služba pro měření proteinů „na dálku“

Beamline X12C

Makromolekulární rtg. krystalografie, MAD, software pro „high-throughput“ makromolekulární krystalografii

Beamline X26C

Vysoká intensita kolimovaného svazku (monochromatické i polychromatické záření)

Beamline X26C

Časově rozlišený „x-ray footprinting“  DNA, RNA a proteinů

 

Poznámky k měření proteinů na zdroji synchrotronovéhozáření

 

Volba zdroje záření a způsobu práce

Při experimentech s vysokým časovým rozlišením je třeba práce s jedním shlukem elektronů na oběžné dráze a obrovskou koncentrací záření na vzorek..

Pro běžný difrakční experiment však vyhovuje každý zdroj synchrotronového záření, který je schopen dosáhnout vlnové délky mezi 4 do 0.2 Ĺ. Pro běžné měření integrovaných intensit též není vyžadován speciální způsob vstřiku elektronů do oběžné dráhy. Kvůli intensitě záření se obvykle pracuje s mnoha shluky elektronů rovnoměrně rozložených po oběžné dráze a získaný svazek záření na ohybovém magnetu a nebona wiggleru je monochromatizován a kolimován zrcadly do kruhového ohniska s pokud možno roznoměrně rozdělenou hustotou záření.

 

Volba goniometru a detektoru

Pro běžná měření je obvykle používán jednoduchý goniometr pro rotační metodu. Pokud je třeba minimalizovat dobu měření, je třeba alespoň čtyřkruhového difraktometru.

Plošné detektory (Image plates) vyžadují poměrně dlouhou dobu čtení. Proto pro rychlá měření dáváme přednost CCD detektorům, které načítají difrakční obraz plynule.

 

 

Bleskové chlazení vzorků

Zařízení obvykle umožňuje nastavení teploty laminárního proudu plynného dusíku na vzorek s teplotou 80-375 K se stabilitou 0.1 K. Spotřeba dusíku  bývá kolem 0.6 litru na hodinu.

 

Radiační poškození vzorku

Uvádí se, že při ozáření 2x107 Gray, které na zdrojích synchrotronového záření lze snadno dosáhnout, dochází zpravidla již k poškození některých částí proteinů a to zejména k porušení disulfidových můstků a k dekarboxylaci koncových skupin organických kyselin. Dochází často k částečným posunům a rotacím molekul nebo jejich částí. Přímo při měření pak můžeme pozorovat zvětšování efektivního rozměru základní buňky nebo pokles intensity reflexí u kontrolních měření. Při zpracování takto ovlivněných dat pozorujeme horší R factor a některé oblasti struktury bývají “disorderované”.

Na zdrojích synchrotronového záření je nebezpečí radiačného poškození vysoké. Snažíme se proto o minimalizaci doby exposice, měříme nejprve nezávislou část reciprokého prostoru a teprve potom se zvyšuje ”redundance” měření.

Zejména při měření anomálního rozptylu mohou být změny intensit reflexí způsobené radiačním poškozením větší než měřený efekt a proto se snažíme měřit Freedelovské páry na tomtéž snímku (framu) nebo alespon v krátkém časovém odstupu za sebou. Porovnání shody kontrolních snímků a objemu základní bunky by mělo být pravidlem.

 

Příklady využití synchrotronového záření

 

Jako příklady využití synchrotronového záření jsou uvedeny následující studie:

1.       Studium inhibice mutantů HIV proteázy, které se objevují u pacientů léčených na AIDS

2.       Studium fázových přechodů u  reversní transkriptázy HIV

3.       Stanovení struktury z krystalků o velikosti desítek mikronů (hmotnost pouze 0.000 000 001 gramu)

4.       Studium biochemických reakcí s časovým rozlišení 100 ps

5.       Experimentální stanovené fází strukturních faktorů

 

 

Literatura

Synchrotronová centra

Zdroje záření pro krystalografii                                                       www.iucr.org/cww-top/rad.index.html

Synchrotron sources of the world                                                     www-als.lbl.gov/als/synchrotron_sources.html

                                                                                                             www-ssrl.slac.stanford.edu/sr_sources.html

Organiz.uživatelů synchr.záření ve strukt.biologii v USA                http://biosync.sdsc.edu/

ESRF Grenoble, Francie                                                                 www.esrf.fr/exp_facilities/BLHB.htm

ELETTRA Trieste, Italie                                                                        www.elettra.trieste.it/experiments/beamlines/index.html

MAX-LAB v Lundu, Švédsko                                                 www.maxlab.lu.se

LURE lab.specializovaná na Kr a Xe prot.krystalografii                www.lure.u-psud.fr/sections/Xenon/XENON_ENG.HTM

Daresbury synchrotron radiation source                                   www.srs.ac.uk/srs/

NSLS Broohaven (www.nsls.bnl.gov)                                            http://nslsweb.nsls.bnl.gov/nsls/beamlines/

SSRL Berkeley  (Advanced Light Source)                                  www-ssrl.slac.stanford.edu/welcome.html.

Advanced Photon Source at Argonne Nat.Lab                                 http://biosync.sdsc.edu/als/als.html

 

Informace

Adresy makromolekulárních krystalografů v Evropě                               www.weizmann.ac.il/esf_xtal/

Databáze pro krystalografy                                                       www.iucr.org/cww-top/data.index.html

Krystalografický software                                                                               www.iucr.org/sincris-top/logiciel/index.html

 

Dodavatelé zařízení pro rtg a neutronovou krystalografii – detektory, difraktometry, atd.

                                                                                                             www.iucr.org/cww-top/sup.index.html

Měření vzorků s anomální difrakcí pro SAD, MAD

Stanice ID29 v ESRF                                                                     www.esrf.fr/exp_facilities/ID29/ID29.html

 

Radiační poškození vzorku

Ravelli RB, McSweeney SM:  Structure 8, 315, 2000.                 www.biomednet.com/library/abstract/JSTR.st8305

Weik M. et al., PNAS Vol. 97, 623-628, 2000.                       www.pnas.org/cgi/content/full/97/2/623.

Raimond B.G. et al. Structure, Vol 8, 315-328, 2000.